什么是數(shù)字PCR？

　　提起PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)，半個世紀以來分子診斷的高速發(fā)展離不開分子生物學技術(shù)特別是PCR技術(shù)日新月異的進步。1983年由美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，標志著PCR技術(shù)的真正誕生。1999年，美國學者KennethKinzler與BertVogelstein提出了數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，實現(xiàn)了核酸拷貝數(shù)定量的突破，成為一種全新的核酸檢測方法，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，具有高靈敏度、高度、高耐受性和定量的優(yōu)點。那么這項技術(shù)究竟有何神通之處？有哪些廣闊的應用前景呢？

　　一、基礎(chǔ)研究篇

　　1.基因表達差異研究

　　數(shù)字PCR由于檢測時*不依賴傳統(tǒng)的Ct值即可實現(xiàn)真正意義上的定量，因而可以提供比實時熒光定量PCR更精確的基因差異表達研究，尤其對于那些靶基因表達差異微小的情況，如：mRNA、microRNA、lncRNAs等的表達分析；等位基因的不平衡表達；單細胞基因表達分析；外泌體核酸分子定量分析等。

　　2.拷貝數(shù)變異（CNV）研究

　　微滴化的樣品處理及檢測，這種擺脫Ct值的計算方法而直接獲取目標基因的拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了的檢測精度。是其他諸如二代測序、芯片雜交等平臺無法達到的。采用數(shù)字PCR能夠有效對二代測序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實驗結(jié)果進行驗證，并具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點。

　　3.低豐度DNA模板分子的精確定量

　　由于絕大部分微液滴中只含單個或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴增不受高豐度模板分子擴增的競爭抑制：與此同時，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進行了相對稀釋，作用于單個微液滴內(nèi)模板擴增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴增對抑制劑的耐受程度，因此可應用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標記物的檢測。一般而言，毛細管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約在10%，NGS的靈敏度可達到1%，而數(shù)字PCR的檢測下限可輕松實現(xiàn)0.001%。

　　4.甲基化含量鑒定

　　作為表觀遺傳學研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來進行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等受限于方法學的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過對樣品的微液滴處理及目標分子的拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種可靠的技術(shù)。

　　5.二代測序輔助建庫

　　目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當擴增引物增加時，由于擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現(xiàn)對于少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數(shù)據(jù)。

　　6.CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗證

　　CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍采取了數(shù)字PCR進行確認。

　　二、疾病研究篇

　　7.腫瘤的液體活檢

　　腫瘤學研究是數(shù)字PCR的重要應用領(lǐng)域，該技術(shù)作為極為重要的工具，能夠識別DNA突變（例如EGFR）、腫瘤患者用藥監(jiān)控、基因擴增檢測、循環(huán)腫瘤細胞（CTC）特性研究、長鏈非編碼RNA檢測、液體活檢中循環(huán)的核酸（cfDNA）和腫瘤細胞（CTC）的定量等研究中。

　　癌癥標志物稀有突變檢測

　　在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關(guān)的突變序列比例較低，經(jīng)常無法檢測。而憑借其超高靈敏度，dPCR系統(tǒng)可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。之前用任何方法都無法實現(xiàn)準確穩(wěn)定檢測的樣本，現(xiàn)在可以使用dPCR輕松進行定量分析。例如，已實現(xiàn)肺癌相關(guān)的表皮生長因子受體（EGFR）中T790M突變的檢測，可以更好地評估抗酪氨酸激酶抑制劑的治療。

　　腫瘤治療的伴隨診斷

　　常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源，前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾，實現(xiàn)腫瘤標記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴增檢測等，應用于腫瘤醫(yī)學的伴隨診斷。

　　腫瘤治療的實時監(jiān)控

　　已有數(shù)篇文章報道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對患者治療過程中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進行檢測，實時監(jiān)控疾病進展。在非小細胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學及其他常規(guī)指標相比，ctDNA突變及豐度改變通常會提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時調(diào)整治療方案，使患者得到更有效的治療。

　　8.糖尿病

　　數(shù)字PCR技術(shù)目前在糖尿病中的研究熱點，通過定量檢測非甲基化DNA的水平，對I型糖尿病β細胞死亡進行定量，從而監(jiān)控病情發(fā)展。

　　9.無創(chuàng)產(chǎn)前篩查

　　無創(chuàng)傷的產(chǎn)前診斷,如21號染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測等。目前無創(chuàng)檢測標本來源主要為孕婦血液，而待檢測的胎兒DNA受到母體DNA的干擾，影響了檢測的準確性。數(shù)字PCR技術(shù)可以作為二代測序法的補充來進行無創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷，從而提高工作效率、降低檢測成本。

　　10.致病微生物（病毒、細菌等）的檢測

　　疾病預防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統(tǒng)的實驗室可以將基于TaqMan探針法的定量PCR體系無縫地轉(zhuǎn)移到數(shù)字PCR上，從而滿足該類實驗室對于檢測結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復性更好、無需依賴標準曲線的定量結(jié)果，同時操作簡便。

　　11.肥胖

　　數(shù)字PCR技術(shù)能夠檢測到引起肥胖的重要因素之一AMY1（唾液淀粉酶）的基因拷貝數(shù)。

　　12.傳染性疾病

　　數(shù)字PCR技術(shù)因起高精密度、耐受能力強、高靈敏度等優(yōu)點，逐漸被用于病毒載量分析的相關(guān)研究。如HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中病毒殘留量的監(jiān)控；HBV耐藥突變的檢測；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內(nèi)感染監(jiān)控；環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。

　　13.移植排斥監(jiān)控中的應用

　　為了降低移植中移植物排斥導致的風險，數(shù)字PCR技術(shù)通過監(jiān)測受體中移植器官供體的循環(huán)DNA水平來檢測早期移植排斥。

　　14.腸道菌群分析：數(shù)字PCR技術(shù)直接計算目的序列的拷貝數(shù)，對樣品中的微生物實現(xiàn)了定量，可用于微生物檢測，以便進一步研究腸道菌群的結(jié)構(gòu)、功能以及數(shù)量。

　　三、其他領(lǐng)域篇

　　15.轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測：目前在確定轉(zhuǎn)基因作物或成分的含量時采取定量PCR的標準曲線法，這種方法需要依賴于已知濃度的標準品(CertifiedReferenceMaterialsCalibrants,CRMCs)。ddPCR定量的方式可以*解決這些標準物質(zhì)的定標工作，從而確保安全和品質(zhì)。

　　16.環(huán)境監(jiān)測：基因目標的環(huán)境監(jiān)測，需要對復雜樣品中低濃度的目標進行準確檢測。ddPCR每次運行中能創(chuàng)建數(shù)千個PCR反應室，帶來了目標的準確測定，即使它們濃度很低，因此可以實現(xiàn)對土壤、污水、淤泥、酒泥等為樣本的環(huán)境生物學研究和病原微生物監(jiān)測。

　　17.基因型鑒定：PCR也可以用于檢測一個生物中是否存在某特定DNA序列，這被稱為基因型鑒定。例如，基因型鑒定可通過發(fā)現(xiàn)樣品中是否存在某種群特異性序列來判斷樣本的真實性?；蛐丸b定還可用于法醫(yī)分析判斷在現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的DNA樣品是否和人的吻合，令兇手無處遁形。

　　18.早期檢驗疫情：2016年，例數(shù)字PCR動物疫病檢測試劑研發(fā)成功，包括H7N9、藍耳病、高致病性美州株、豬的流行性腹瀉等動物疫病檢測試劑盒。此項技術(shù)的推出，將有助于在食品安全的源頭及早發(fā)現(xiàn)疫情，盡早處理避免更大面積的傳染，更好地控制漏檢，減少傳染人的幾率；也將有助于國家建立規(guī)范化、規(guī)?；膭游镆卟⌒滦蜋z測方法。

　　19.藥物基因組檢測：能夠通過PCR技術(shù)實現(xiàn)藥物基因組的檢測，提高合理用藥水平，具有通量較高，操作簡單，儀器設(shè)備易普及等優(yōu)點。